Question:
Qu'est-ce qu'un bon protocole miniprep pour la salle de classe?
shigeta
2011-12-15 04:39:07 UTC
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J'essaie de trouver un bon protocole pour les minipreps plasmidiques et je regarde 3 préparations que j'ai trouvées:

  1. Utilisation de phénol / chloroforme
    • extrait au phénol: chloroforme: alcool isoamylique,
    • précipitation d'isopropanol, 12 000g essorage,
    • rincer à l'éthanol froid à 70%.
  2. Utilisation du lysozyme
    • lyse avec du lysozyme,
    • retirer le culot,
    • précipitation d'isopropanol,
    • laver avec de l'éthanol à 80% froid.
  3. Utilisation de la lyse alcaline
    • ouvrir cellules avec 80% de glucose dans le tampon EDTA,
    • ajouter du SDS et du NaOH,
    • pastille protéine / membrane avec acide acétique / acétate,
    • précipitation à l'ispropanol,
    • laver avec de l'éthanol à 70% froid.

Ils diffèrent tous dans la façon de casser les cellules et de séparer les plasmides du reste de la cellule -- un peu. Quelqu'un peut-il m'aider à déterminer quel protocole est le meilleur ici?

Voulez-vous vraiment que les élèves utilisent du phénol? La plupart des laboratoires utilisent probablement des kits d'extraction d'ADN (par exemple, Quiagen MiniPrep). C'est beaucoup plus facile et aussi plus sûr.
Je vais marquer la réponse de Reven comme la meilleure car elle m'aide le plus à choisir parmi les protocoles. mais merci d'avoir souligné à quel point les kits qiagen sont bon marché - je pensais qu'ils étaient bien pires. vous apprenez quelque chose en utilisant un protocole, mais les colonnes sont faciles!
Pour info, il est vrai environ 1-2 $ par pré pour les colonnes de rotation, mais le coût du réactif pour SDS / NaOH est d'environ 40 cents par préparation. vous devez faire plus de 100 préparations pour voir les économies.
Je voulais juste mettre à jour que j'ai acheté des colonnes de biobasic et bien que ce ne soit pas aussi bien pour l'instruction que ces protocoles de base, ils sont certainement assez bon marché et devraient être considérés pour la classe - des votes positifs tout autour.
Les colonnes @MadScientist Spin sont en effet l'option la plus courante, mais il y a un angle pédagogique: il n'y a pas grand-chose à apprendre sur le suivi d'un manuel de kit, mais une extraction PCI enseigne une biochimie importante. Même si les purifications de routine sont effectuées avec des colonnes rotatives, PCI peut être une solution de secours précieuse lorsque vous vous retrouvez coincé parce que des impuretés continuent de traverser votre colonne.
à la fin, j'ai parlé de ce que fait chaque étape de la préparation du spin et cela fonctionne très bien. les anciennes méthodes ne sont pas vraiment beaucoup plus rigoureuses quand on parle de changement de pH d'affinité sur la silice, etc.
Cinq réponses:
#1
+7
Nick T
2011-12-15 05:09:02 UTC
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Le protocole que j'ai utilisé dans mon cours de laboratoire de génétique était la lyse alcaline suivie d'une précipitation à l'éthanol similaire à celle-ci. Rien de terriblement toxique ou nécessitant une hotte (du moins pour les petits volumes utilisés).

La méthode la plus pratique et la plus fiable consiste à utiliser un kit miniprep (généralement des colonnes de rotation) de l'un des nombreux fournisseurs ( Qiagen, Promega, Bio-Rad, etc.) qui sont assez abordables à 1-2 $ par préparation.

Si je me souviens bien, la lyse alcaline * est * la méthode sous-jacente des kits de purification d'ADN Qiagen (miniprep, etc.). Avec les colonnes de rotation du kit, vous évitez les précipitations d'alcool et le séchage. Cela ne semble peut-être pas grand-chose, mais cela vaut le prix du kit car il élimine plus de 10 minutes et une étape sensible du protocole. Mes deux cents: vous ne voulez pas utiliser de phénol en classe.
Tous les kits de préparation que j'ai utilisés (Qiagen, Promega, Invitrogen) utilisent une lyse alcaline. J'aime les colonnes juste pour ne pas avoir à me soucier de l'évaporation totale de tout l'éthanol (je les utilise avec un collecteur à vide donc je suce pendant une minute ou deux de plus pour laisser tout s'évaporer) ou à la recherche d'un granulé à moitié invisible .
Aimer cela plus une fois, j'ai trouvé les recettes de qiagen sur Open Wet Ware .. http://openwetware.org/wiki/Miniprep/Qiagen_kit me fait me sentir mieux en l'utilisant dans une classe.
#2
+6
yamad
2011-12-22 15:13:24 UTC
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Je pense que les kits de colonnes rotatives sont la solution. Comme mentionné précédemment, les avantages des kits sont qu'ils sont faciles, sûrs et (surtout) comment presque tous les laboratoires effectuent la purification des plasmides de nos jours.

La plus grande critique des kits commerciaux est que vous pouvez vous débrouiller facilement sans rien savoir de ce qui se passe réellement dans le tube. Cependant, comme indiqué dans les commentaires sur la réponse de Nick T, il n'y a pas de technologie propriétaire secrète dans les kits - ils utilisent la méthode de la lyse alcaline . Cela signifie que vous pouvez toujours enseigner le mécanisme dans la classe tout en profitant des colonnes rotatives.

Une option, à des fins d'enseignement, est de créer toutes vos propres solutions et d'utiliser simplement les colonnes rotatives sur le surnageant après granulation de la membrane / protéine précipitée. De cette façon, vous obtenez l'avantage d'insister sur les vrais noms pour les solutions (NaOH est un nom plus éducatif que P2) et vous pouvez utiliser les colonnes de rotation à la place de la précipitation à l'éthanol. Je pense qu'il existe des sources bon marché qui ne vendent que les colonnes de spin, même si je ne les ai jamais utilisées. Vous voulez éviter la précipitation à l'éthanol car cela ajoute un minimum de 30 minutes au protocole (pour mes protocoles, c'était plutôt une heure et demie ou plus). Et attendre que l'éthanol s'évapore pour pouvoir remettre en suspension, c'est comme regarder la peinture sécher à moins d'avoir un aspirateur rapide.

Le rendement ne devrait pas être un gros problème dans une situation de classe, mais vous pouvez augmenter le rendement avec la colonne en prolongeant l'étape d'élution finale. Je pense que l'instruction donnée est de laisser le tampon TE (Tris) "éluer" pendant 1 minute avant le spin final, mais j'ai régulièrement laissé le TE reposer pendant environ 15-30 minutes avant de tourner vers le bas. La différence de rendement a anéanti l'exposition de l'appareil photo à gel.

Il existe certains cas où les extractions au phénol: chloroforme sont toujours souhaitables, mais ce n'est certainement pas l'un d'entre eux. J'avais l'habitude de faire des P: C régulièrement lorsque je travaillais avec de l'ARN et de l'ADN génomique de levure. Je n'ai jamais vu personne faire autre chose qu'un miniprep lors de la préparation de plasmides. De plus, les tracas liés au travail sous une hotte et le risque de brûlures au phénol ont encouragé beaucoup de personnes du laboratoire à préférer les kits d'essorage même lorsqu'ils travaillent avec de l'ADN génomique.

après quelques efforts, nous sommes passés aux kits de spin ...
#3
+4
Reven
2011-12-15 05:52:23 UTC
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D'après mon expérience, la méthode P: C: I vous permettra d'obtenir des rendements plus élevés et est un peu plus simple (en étapes et en étapes), mais comme l'a dit @Mad Scientist, l'utilisation de phénol pourrait être un problème. Cela dépend de l'âge de vos élèves.

Ce n'est pas seulement l'âge des étudiants, cela dépend aussi des installations disponibles. Vous avez besoin d'une hotte par exemple, et vous avez besoin d'un service disponible pour l'élimination du phénol.
Le phénol et le chloroforme sont hautement toxiques et cancérigènes et ne devraient certainement pas être utilisés par les étudiants ou en dehors d'une hotte appropriée.
#4
+4
user91
2011-12-15 06:47:21 UTC
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À l'aide de colonnes rotatives, mon professeur et moi avons extrait ~ 30 plasmides d'environ 30 échantillons en quelques heures. C'est facile, bon marché et cela donne un plasmide de bonne qualité. Mon échantillon a été quantifié par les spécifications UV et il était à environ 200 ng / ul.

#5
  0
George
2014-02-01 08:25:24 UTC
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Pour réduire les coûts, vous pouvez acheter des colonnes tournantes uniquement auprès de fournisseurs tels que Syd Labs ( http://www.sydlabs.com/spin-column-for-plasmid-miniprep-p110.htm ) et créez des tampons faits maison. Les fournisseurs fournissent normalement la recette tampon.



Ce Q&R a été automatiquement traduit de la langue anglaise.Le contenu original est disponible sur stackexchange, que nous remercions pour la licence cc by-sa 3.0 sous laquelle il est distribué.
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