Biosécurité des lentivecteurs

Katz

2015-05-04 21:43:16 UTC

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Les lentivecteurs sont largement utilisés en biologie moléculaire, le plus souvent pour transduire de manière stable un gène souhaité. Ces systèmes de vecteurs tirent parti de la capacité des virus à introduire leur propre génome dans la cellule hôte. Ainsi, les lentivecteurs sont transfectés dans une lignée cellulaire productrice (typiquement HEK) et des virus sont produits avec l'insert souhaité. Finalement, ces virus seront récoltés et les lignées cellulaires souhaitées transduites.

Pour des raisons de biosécurité, ce système est conçu de manière à réduire le risque posé par le «système viral». Ainsi, les virus produits par ce système sont incapables de se répliquer, c'est-à-dire que, pour autant que je sache, les virus qui se forment sont alors incapables de se former davantage dans le second hôte car les gènes en charge ne sont pas recrutés. Pourtant, apparemment, les plasmides utilisés peuvent se recombiner et offrir la possibilité de créer un virus capable de se répliquer. Pourtant, d'après ce que j'ai trouvé dans la littérature, cela n'a jamais été détecté et constitue une possibilité théorique.

Ma première question, en chiffres réels, quelle est la probabilité qu'un tel événement se produise (le nombre de recombinaisons dans les emplacements spécifiques) . Dans le cas où cela se produirait, le système lentivecteur serait potentiellement dangereux, car ce système est basé sur le VIH la plupart du temps. De plus, ces vecteurs n'utilisent pas la protéine d'enveloppe endogène du VIH mais plutôt le VSV / G du virus de la stomatite vésiculaire, afin d'augmenter le tropisme et la stabilité.

De plus, même s'ils sont dérivés du VIH, la plupart des gènes du VIH sont retirés des lentivecteurs, mais à mon avis, les plus importants sont là. Deuxième question, compte tenu de tout cela, ce virus "créé" théorique pourrait éventuellement causer le SIDA ou tout autre effet indésirable? il est à noter qu'il est maintenant capable d'infecter presque toutes les cellules humaines en raison à la protéine VSV, alors est-il correct de penser que la maladie serait bien pire et bien plus contagieuse que le VIH d'origine? notez que même la stabilité est augmentée.

Pourtant, je peux en plus penser que ce nouveau virus recombinant pourrait bien être détruit par le système immunitaire, malgré le tropisme accru, du fait que le virus de la stomatite vésiculaire ne provoque pas de pathologies chez l'homme, et peut-être cela La protéine fonctionne comme un antigène et peut induire une réponse immunitaire suffisante.

Enfin, un virus recombinant théorique serait-il détecté par un test VIH standard?

Pour simplifier choses, je fais référence aux lentivecteurs de troisième génération

Je ne sais pas ce que vous entendez par «les plasmides utilisés peuvent se recombiner», il n'y a pas de plasmide contenant le génome viral, seulement l'enveloppe et quelques protéines réceptrices. Le reste du génome viral n'est même pas présent, il a été remplacé par le gène d'intérêt que vous avez ajouté. Par conséquent, il serait pratiquement impossible de créer un virus actif en utilisant seulement trois ou quatre gènes, même si nous essayons. Peut-être ai-je mal compris votre déclaration ci-dessus, corrigez-moi si je l'ai fait.

Je dirais qu'il est plus probable qu'un vecteur lentiviral soit utilisé sur un patient qui a une infection à VIH active. Cela pourrait aussi hypothétiquement permettre au gène recombinant d'être incorporé dans un virus fonctionnel. Cela ne s'est probablement pas encore produit parce que le nombre de personnes recevant des vecteurs lentiviraux jusqu'à présent est vraiment faible (peut-être zéro? Je n'ai pas entendu parler d'essais cliniques lentiviraux, mais je n'ai pas regardé non plus)

CDB> l'enveloppe (VSVg), plus le gène gag (polyprotéine), le gène pol (intégrase, transcriptase inverse, RNAse H, protéase du VIH), le gène rev (exportation d'ARNm viral à partir du noyau) trouvé dans les lentivecteurs transfectés peuvent se recombiner plusieurs fois dans afin de produire un morceau d'ADN «proviral» capable de coder tous ces gènes dans les générations postérieures.

Luigi> merci pour votre answeruser137> Je ne vous comprends pas. Pour commencer, comment voulez-vous transduire de manière stable les virus VIH déjà existants avec ce système? De plus, même si c'est le cas, vous auriez un VIH transgénique, mais il est hors de question de penser que vous cibleriez chaque particule de VIH dans le corps en tant que telle, de sorte que celles-ci continueraient à perpétuer l'infection + la maladie. D'ailleurs, quel gène voulez-vous transduire en virus pour le tuer? et oui je pense qu'il existe de telles études, mais revérifiez.

@Katz Je dis que vous pourriez accidentellement utiliser un vecteur lentiviral chez un patient atteint du SIDA, ou que quelqu'un qui reçoit le vecteur lentiviral pourrait plus tard contracter le VIH. Si les deux virus touchaient la même cellule, l'ADN recombinant délivré par le lentivirus pourrait être transcrit en un ARN viral, emballé dans une capside et envoyé dans le corps pour infecter de nouvelles cellules ou peut-être d'autres personnes. Bien que ce nouveau virus ait probablement un déficit de réplication, il pourrait causer des problèmes. Ceci et d'autres raisons expliquent pourquoi je n'aime pas la thérapie génique virale.

tant qu'il n'est pas capable de réplication, je ne me soucierais pas de la génération de virus incompétents pour la réplication, ils ne peuvent pas produire de maladie et le seul risque qu'ils présentent est la mutagenèse insertionnelle, ce que je ne pense pas que ce soit trop mauvais en termes de statistiques (corrigez-moi sinon ), le seul problème que je pense est que dans le cas où les virus produits par le lentivecteur ont un oncogène comme insert, alors oui, cela pose un risque plus élevé. En ce qui concerne la pathogénéité virale, le vrai problème est que même le virus incompétent pour la réplication peut devenir réplicatif en raison de réarrangements génétiques.

Je veux connaître le risque réel que cela se produise, le cas échéant, les chances réelles de générer une maladie, et aussi si ce virus théorique serait détectable> si nous sommes totalement aveugles pour vérifier tout événement accidentel qui pourrait survenir lors de la manipulation de lentivecteurs ou non

Combien de recombinaisons sont nécessaires pour obtenir un virus actif?

La FDA a reconnu la probabilité que les lentivecteurs puissent être convertis en lentivirus à réplication active s’ils subissent une recombinaison avec le type sauvage VIH chez un patient séropositif. Dans ce cas, deux événements de recombinaison sont nécessaires pour transférer la séquence lentivecteur dans la séquence VIH (le mécanisme de transfert est identique au cas des lentivecteurs de première génération).

Cet article de VCU décrit un autre mécanisme par lequel cela peut se produire dans les systèmes lentivecteurs de première génération , qui consiste en deux événements de recombinaison entre le lentivecteur et le plasmide auxiliaire. Notez que les 3 gènes gag, pol et env sont présents sur le même plasmide, et que ce plasmide est flanqué de LTR. Les lentivecteurs de deuxième génération, tels que le système pLKO, ne souffrent pas de ce problème et ont besoin du VIH de type sauvage pour produire des lentivirus à réplication active.

Pour réduire la probabilité que cela se produise, les systèmes lentivecteurs de deuxième et troisième générations divisent les gènes en plusieurs plasmides, ce qui nécessite alors plus d'événements de recombinaison pour produire des virus capables de se répliquer. De plus, la queue polyA de la LTR 3 'est remplacée pour réduire la probabilité que des événements de recombinaison se produisent.

Selon l ' article d'Addgene sur la biosécurité des lentivecteurs, le plasmide de transfert du gène d'intérêt (à la fois des 2e et 3e générations) a une délétion dans la région 3' LTR qui l'empêche de devenir réplicative active. Par conséquent, la seule probabilité que la recombinaison se produise est que la lignée cellulaire exprimant le virus subisse une réplication avec une souche active de VIH de type sauvage. Un exemple est ce plasmide de transfert pLKO, qui contient une LTR 3 'tronquée, empêchant la séquence de se répliquer en dehors de E. coli , qui le réplique sans utiliser le LTR mais à la place en utilisant l'origine plasmidique de réplication.

Les virus actifs produits par recombinaison sont-ils plus dangereux à l'état sauvage que le VIH de type sauvage?

Il est difficile de répondre, car la recombinaison ne permet qu'un virus actif de se former, mais c'est le cas ne garantit pas que le virus sera dangereux. Des virus dangereux sont théoriquement possibles, mais nécessitent beaucoup plus de recombinaisons que le minimum 2 pour la compétence de réplication dans les systèmes lentivecteurs de 2ème génération.

Par exemple, les systèmes lentivecteurs ne codent généralement pas pour les protéines virales vpr, vif , nef et vpu . Ces protéines sont nécessaires pour augmenter l'infectivité du VIH dans différents types de tissus (mais pas dans les cellules cultivées telles que HEK293). Le manque de ces protéines dans un lentivecteur hypothétique compétent pour la réplication entraverait considérablement sa propagation dans la nature. L'incorporation de ces protéines est plausible mais extrêmement improbable, car davantage d'événements de recombinaison croisée seront nécessaires.

Pour utiliser votre exemple, la protéine env codant pour l'enveloppe de la protéine VSV réside dans le plasmide d'enveloppe. Étant donné que le lentivecteur compétent pour la réplication formé par 2 événements de recombinaison sera un pseudotype contenant uniquement les protéines du VIH env , il devra en outre acquérir le gène VSV pour remplacer son env , car ces gènes ne sont pas présents sur les mêmes régions. Il n'y a pas d'homologie entre les deux brins d'ADN, ce qui entraverait considérablement la probabilité que le gène VSV soit en quelque sorte incorporé dans le VIH actif.

L'ajout de diverses protéines chimériques et régions LTR dans les lentivecteurs de 3ème génération ne fait que compliquer les choses.

Dans l'ensemble, je n'ai pas pu trouver de sources comparant l'infectivité de ces VIH transgéniques théoriques par rapport au type sauvage. Cependant, même s'il est théoriquement possible qu'un lentivecteur compétent pour la réplication transgénique puisse avoir un meilleur tropisme que le VIH en acquérant le gène VSV, la probabilité que cela se produise est bien inférieure à celle de sa production en premier lieu.

Un lentivecteur peut-il être détecté par un test VIH?

En ce qui concerne la question finale de savoir si un lentivecteur peut être détecté par un test VIH standard, la réponse est que la détection est possible si la personne qui a été infectée par des lentivecteurs a obtenu une réponse immunitaire aux protéines gag lentivectorales, et les charges de lentivecteurs sont suffisamment élevées.

Les tests de dépistage du VIH sont spécifiques à différentes parties du virus, mais la plupart d’entre eux ciblent la protéine virale p24, qui est une composante du gag polyprotéine.

Des tests VIH basés sur la PCR existent également, mais ces tests dépendraient des amorces spécifiques produites et si la RT-PCR produirait un amplicon étant donné la séquence spécifique des plasmides.

Étant donné que les gènes gag sont codés pour dans la plupart des systèmes lentivecteurs, il est donc très probable que toute personne infectée par un lentivecteur exprime donc des anticorps dirigés contre p24, et donc entraîne également un résultat positif pour l'ELISA comme les tests Western blot en supposant que les quantités de p24 et d'anticorps sont suffisamment élevées pour atteindre le point de coupure.

Je n'ai pas été en mesure de trouver des seuils publiquement disponibles pour les niveaux ELISA et Western blot, mais si (hypothétiquement parlant) une personne recevait une injection de lentivecteurs, elle serait probablement testée positive pour le VIH. Cependant, comme le lentivecteur ne se reproduit pas activement, il serait rapidement éliminé par le système immunitaire.